前几天的一个研讨会上，有个课题是《菌株鉴定和分型技术在微生物溯源中的应用》，联系到7月头在上海闹得沸沸扬扬的“一笼小确幸”沙门氏菌污染事件，以及近期的“三只松鼠”霉菌污染事件，在我们微生物圈内掀起了不小的波澜，大家纷纷在讨论如何更好的追溯食品微生物的污染源头，以及如何更好的提高食品安全管理技术。

为此，我们实验助手APP邀请了沈泓老师，为我们分享一下她眼中的：食品污染菌追踪溯源技术。

作者：沈泓

编辑：兔兔子

来源：实验助手APP

食品污染菌追踪溯源技术浅析

首先，感谢实验助手APP邀请我做这样一个课题分享，以下内容都是我自己的个人经验和看法，欢迎大家在文末留言讨论！

为了更好的开展话题，我们先来回顾下前文提到的“一笼小确幸”沙门氏菌污染事件的始末。

“一笼小确幸”沙门氏菌污染事件

“一笼小确幸”是一家在起步于上海的网红餐饮店，目前有9家门店，由中央厨房提供部分餐食。

今年7月15日前后，网友爆料称，在“一笼小确幸”吃完饭之后，肠胃不舒服，甚至高烧挂盐水；“一笼小确幸”虹口龙之梦店等4家门店遭到集中投诉。

7月25日，上海市食药监局最新通报了“一笼小确幸”事件的调查结果。调查显示，该事件系其中央厨房违规加工一款名叫“拿破仑”点心所致，共有71人食物中毒。

在“一笼小确幸”餐厅用餐后发生胃肠道不适发病人员的主要症状为发热、腹泻，部分病人肛拭和餐厅门店采集的食品样品中检出沙门氏菌。上述用餐后发生胃肠道不适的消费者，发病前均在“一笼小确幸”门店用过餐。

结论：食品在加工过程中受到沙门氏菌污染。

最终上海食药监的调查结果显示，其食品在加工过程中受到沙门氏菌污染，今天我们就不谈如何预防沙门氏菌污染这种老生常谈的问题，这个事件中，我们更加应该关心，沙门氏菌污染的溯源问题。

这个沙门氏菌是从哪里污染的？原料？人员？环境？

只有追踪溯源到污染的源头，查清楚原因，才能建立良好的食品安全控制体系，长远的维护食品安全。

要识别污染风险及追踪溯源，第一步是要准确识别、鉴定微生物。

污染菌的鉴定

鉴定微生物的方法主要有表型鉴定及基因型鉴定技术。表型鉴定技术是我们实验室常用的鉴定方法，包含了菌落形态、细胞形态、生理学、生化反应、抑制性、血清学、化学分析、生态学等，会应用到API、BIOLOG、VITEK2、VIDAS、MALDI-TOFMS等仪器或试剂。

但是，微生物由于特殊环境影响，表型特征常发生变异，传统形态学鉴定手段难以得到种水平结果，以基因型鉴定手段，可以从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系。

基因型鉴定技术包含了DNA杂交、聚合酶链反应、16SrRNA序列、18SrRNA序列、多位点序列分型、焦磷酸测序、DNA探针、核糖体分型、GC含量、限制性酶切图谱等。

知道是哪些微生物污染后，我们接下来更为关心的是：这些污染菌是从哪儿来的？

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污染菌的溯源技术

年，德国发生肠出血性大肠杆菌O：H4感染引起的暴发疫情，疫情从德国北部起始，席卷整个德国和欧盟其他国家，并蔓延至美国和加拿大。欧盟有关组织和德国相关部门开展了溯源和追踪调查，通过多种分子溯源技术，最终追溯至由埃及进口的葫芦巴豆种子。

溯源分析是通过对污染微生物和相关环节监控微生物进行比对，以同源性的差异程度为依据，确认污染来源的过程。

目前常见的微生物污染溯源方法有基于电泳谱图差异和核酸序列差异，各具特点。列举如下：

（一）基于扩增原理的方法

1.随机扩增多态性DNA标记（RAPD）

由于整个基因组存在众多反向重复序列，单一引物与反向重复序列结合。使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过染色以检测DNA片段的多态性。

它的分辨力高，但是可重复性差，图谱很难解释，实验步骤繁琐。

2.重复序列PCR技术(REP-PCR）

REP-PCR所使用的引物是以短的基因外重复序列为基础的。肠杆菌科成员、一些革兰氏阳性菌和真菌中，都有这些序列，一般说来，这种序列在细菌染色体上有许多位点。当两个序列的距离足够近时，那么位点之间的DNA片段将被有效的复制。因为重复序列的数目和位点变化很大，所以不同菌株扩增产生重复片段的大小和数目也就相应的不同。

它有较好的重复性，实验步骤比较简单，但是分辨率一般。

（二）基于限定性核酸内切酶的方法

1.脉冲场凝胶电泳（PFGE）（★★★★）

用识别位点相对多的酶进行REA的一个重要的局限性，是分析那些大量的、重叠的、分辨力较差的限制性酶切片段构成的图谱相当困难。如果用限制性位点相对少的酶消化细菌的基因组，那么就可以得到数量相当少但更大的限制性片段，这样在电泳中，穿过琼脂糖的电场作周期性的改变，就可以产生一个有5-20条清晰的分辨较好的图谱。

PFGE方法的分辨力和可重复性都很高，是肠球菌、肠杆菌和葡萄球菌基因分型的金标准，已有标准化操作方案，并实现数据分析的网络化。但是该法需要昂贵的专业设备，耗时，对人员要求高。

2.限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）

RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。

能对所有携带与探针同源基因的菌株进行分型，实验的重复性很高。但是样品用量大、纯度要求高。探针设计的难度大，分析技术步骤繁琐，工作量大，成本较高。

3.扩增片段长度多态性（AFLP）

由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检出多态性。

它的分辨力高，但是引物需要同位素标记，对样品DNA质量要求严格。实验中需要用到毛细管电泳。

（三）基于杂交技术的方法

1.核糖体分型（Ribotyping）

核糖体操纵子包括编码16SrRNA和25SrRNA以及一种或多种RNA的核苷酸序列。核糖体序列高度保守，针对大肠杆菌rRNA制备的探针，或者是克隆的核糖体操纵子，可与许多细菌的染色体核糖体操纵子杂交，细菌的基因组中通常有多个核糖体基因，分别存在于不同长度的酶切片段中，因此核糖体分型可以得到类似指纹的结果。

核糖体序列高度保守,用大肠杆菌rRNA制备的探针能对所有的细菌进行分型。

它的分辨力一般。流行病学上无关的菌株，有可能有相同的核糖体型图谱。需要用到放射性同位素，成本很高，实验步骤繁琐。目前在国际上已有完全自动化的仪器，排除了人为因素对实验结果的影响，重复性好结果稳定，但是仪器和试剂昂贵。

（四）基于基因测序的方法

1.多位点序列分型（MLST）

通过分析多个管家基因bp左右的核心片段的核酸序列，从而对菌株的等位基因进行多样性的比较,不同的菌株对应不同的序列型。不同的等位基因指派一定的数值，生成等位基因谱，每个等位基因谱认定为一个序列型(ST)进化树确定亲缘关系。

它的分辨力一般，操作简单快速。

2.多位点可变串联重复序列分型(MLVA)

将串联重复序列的拷贝数进行数字编码，然后根据每株菌数字编码的不同，利用相关软件通过计算机来对这些菌株进行自动分型。

该方法操作简单，重复性好，分辨力高，能在较短时间内处理大量的样品。

3.全基因组序列分型（★★★★★）

原理是是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。

以高输出量和高解析度为主要特色，能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列读取，在提供丰富的遗传学信息的同时，还可大大降低测序费用、缩短测序时间的测序技术。

与传统的分型方法相比，分辨力更高。结果可以在不同实验室之间比较，共享。便于标准化和数据化，并有望成为最精准的分型方法。关键区域的溯源调查可通过全基因组深入。

关于菌株分型，PFGE是现在进行时，全基因组测序是未来趋势。

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实际溯源分析工作的难点

前面讲了那么多关于分型的技术，在实际污染菌溯源工作中，合理的分型方法是核心，不同的菌株适用的分型方法不同，方法选择时注意对病原菌的区分能力。不适合的分型方法可能会导致本该一样的菌株出现不同的分型结果。在菌株相似性比较、种群结果分析或是遗传进化分析需选择不同的分型方法。实际应用中，要考虑分辨力，可重复性，性价比以及结果的判读。

另外，准确的数据分析是分型应用的关键。包括图像数据、分类数据和序列数据的分析。会做聚类图，不等于会对结果进行分析和判读。完备的分子分型实验室，不仅需要专业的实验设备，还需要配备相应的数据运算服务器和生物信息人员。

一个独立的实验室使用的分型数据是有用的，但是这些数据被多个实验室共享后其价值更为大大增强，UniversityofWarwick的MLST数据库就是一个很好的例子，这个数据库可以被全世界用户访问。来自于公共卫生实验室的电子数据报告和大规模公共卫生监督数据库的建立为这些问题提供了解决方案，这些系统成功运作的一个共同点是建立了一个集中的、综合的、尽量完整的数据库。

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总结及展望

近几年，随着我国对食品安全的要求更加严格，相应技术也在逐年进步，相关食品安全法律法规也在不断完善，并且逐渐与国际接轨。“国家致病菌识别网”“食源性疾病分子分型溯源网”等国家级项目的建立和开展，更加预示着我国对食品安全微生物污染事件有了具体的规划。

好了，今天就先阐述那么多，以上均是本人自己的观点和见解，如有错误的地方，还请大家在多多指点！

对了，文章发布出来应该刚好是七夕节，祝福大家七夕快乐~

.08.25

讨论专区

本文作为系列文章的第一篇，希望起到一个抛砖引玉的作用，就如上文沈老师所说，食品污染菌溯源是一个复杂的技术难题，不同的情况下需要使用不同的技术，未来还有很长的路要走，我们希望与大家一起探讨食品安全未来的发展之路！

这里留下2个问题给大家思考，欢迎大家在文末留言发表自己的意见：

目前你们单位对于污染菌溯源，使用的是什么技术？

对于目前的主流的PFGE技术，和发展中的基因组测序技术有什么看法？

如果您对食品污染菌追踪溯源有一些自己的看法，欢迎来稿，可以联系我们客服兔兔子小姐姐：







































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